استحصال و جداسازی ترکیبات آلی باکتری‌های همراه قارچ‌های کلاهکدار خودرو و بررسی اثر ضد میکروبی آنها علیه Pseudomonas tolaasii، عامل بیماری لکه قهوه‌ای قارچ خوراکی Agaricus bisporus
کد مقاله : 1228-24IPPC (R3)
نویسندگان
1گروه گیاهپزشکی دانشکده کشاورزی دانشگاه کردستان
2عضو هیات علمی گروه گیاهپزشکی دانشکده کشاورزی، دانشگاه کردستان
3عضو هیات علمی گروه فارماکوگنوزی دانشکده داروسازی، دانشگاه علوم پزشکی کرمانشاه
چکیده
باکتری tolaasii Pseudomonas عامل بیماری لکه قهوه‌ای قارچ خوراکی Agaricus bisporus است که از لحاظ اقتصادی دارای اهمیت زیادی می‌باشد. به دلیل اثرات مخرب زیست محیطی استفاده از سموم شیمیایی برای کنترل بیماری های گیاهی، محققین به دنبال منابع زیستی هستند، که با مکانیسم‌های مختلف قادر به کنترل بیمارگرهای گیاهی باشد. هدف از مطالعه حاضر، استحصال ترکیبات آلی تولید شده توسط باکتری‌های همراه قارچ‌های خودرو کلاهکدار و بررسی پتانسیل آنها در جلوگیری یا کاهش رشد P. tolaasii می‌باشد. بمنظور غربالگری اولیه،40 جدایه باکتری همراه که قبلا از قارچ‌های کلاهکدار خودرو جداسازی شده بودند، انتخاب و جهت استحصال ترکیبات آلی، سوپرناتانت حاوی ترکیبات آلی با کشت باکتری‌ها در محیط کشت کینگز- ب براث ( ˚C25، rpm 150، 48 ساعت) و ترسیب باکتری‌ها با سانتریفیوژ کردن محیط‌های فوق (˚C4 و rpm 7000) تهیه گردید. l100µازسوپرناتانت‌ها درون چاهک‌هایی به قطر شش میلی-متر در محیط کینگز ب آگار که قبلاً P. tolaasii OD600nm≃0.1)) بصورت چمنی روی آن کشت شده بود، ریخته و اثر بازدارندگی بعد از 48ساعت در ˚C25 با اندازه‌گیری قطر هاله‌ی بازدارنده‌ی (mm) اطراف چاهک محاسبه شد. جدایه‌های دارای بیشترین اثر بازدارندگی انتخاب و ترکیبات موثره‌ی آنها با کاربرد حلال اتیل استات درون محیط کشت مایع باکتری‌های همراه ( حجمی:حجمی 1:1) استحصال و اثر بازدارندگی آنها با اندازه گیری قطر هاله بازدارنده (mm)P. tolaasii به روش دیسک کاغذی در غلظت mg/Disc5 محاسبه شد. جداسازی فراکسیون‌های ترکیبات موثره‌ی جدایه‌های همراه با Vacuum liquid chromatography و کاربرد حلال استو نیتریل به نسبت‌های (10، 20، 40، 60، 80 و 100 درصد) در ستون کروماتوگرافی Rp-18 تحت خلاء انجام شد. سپس اثر بازدارندگی هر فراکسیون علیه P. tolaasii، به روش دیسک کاغذی مورد بررسی قرار گرفت. نتایج غربالگری اولیه نشان داد از 40 جدایه‌ی باکتری همراه، سوپرناتانت شش جدایه با ایجاد هاله‌ی بازدارنده، از رشد باکتریP. tolaasii جلوگیری نمودند. بین این شش جدایه، بیشترین اثر بازدارندگی مربوط به Pseudomonas koreensis با قطر هاله‌ی بازدارنده به میزان 65/ 0± 97/16میلی‌متر و کمترین آن مربوط به Pseudomonas chlororaphis با قطر هاله بازدارنده به میزان 35/ 0± 87/9 میلی‌متر بود. نتایج اثر بازدارندگی ترکیبات موثره استخراج شده با حلال اتیل استات نشان داد که P. koreensisبا قطر هاله‌ی 04/1 ±75/20 میلی‌متر دارای بیشترین تاثیر بازدارندگی از رشدP. tolaasii می‌باشد. در مطالعات جداسازی ترکیبات، شش فراکسیون از هر جدایه‌ی منتخب جداسازی گردید و نتایج اثر بازدارندگی هرفراکسیون نشان داد که فراکسیون سه در Bacillus mycoides و P. koreensis، فراکسیون پنج در Enterobacter sp. وP. koreensis، فراکسیون شش در P. koreensis اثر بازدارندگی از رشدP. tolaasii را نشان دادند. در تحقیق حاضر مشخص شد که برخی باکتری‌های همراه با قارچ‌های خودرو توانایی تولید ترکیبات ضد میکروبی را دارند که می‌توانند با مطالعات تکمیلی به عنوان یک عامل دارای پتانسیل مهار زیستی بیماری لکه قهوه‌ای کلاهک قارچ خوراکی معرفی گردند.
کلیدواژه ها
Title
Extraction and separation of organic compounds produced by endofungal bacteria and their antibacterial effects against Pseudomonas tolaasii, the causal agent of Agaricus bisporus brown blotch
Authors
Abstract
Pseudomonas tolaasii causes brown blotch disease in the economically important cultivated mushroom, Agaricus bisporus. Different approaches, for example, chemical treatment, management of physical conditions of mushroom growth and resistant mushroom strains have been used to overcome this disease, but all methods showed limited success The objective of the present work was to extraction of organic compounds produced by endofungal bacteria isolated from wild growing mushrooms and investigation of their antibacterial effects on reducing the growth of Pseudomonas tolaasii. Forty endofungal bacteria previously isolated from wild growing mushrooms were grown in king’ B-Broth medium (incubated in 25˚C on shaker 150 rpm at 48 hours) and supernatant containing organic compounds were obtained by centrifugation (7000 rpm, 4˚C). The inhibitory effects of supernatant were examined by measuring of the inhibitory radius zone (mm) of P. tolaasii culture (incubated in 25˚C) around of well containing 100 µl supernatants. The isolates with inhibitory effect were selected, grown in liquid culture and organic compounds were extracted using ethyl acetate solvent (1:1 v/v). Organic compounds obtained were examined for their inhibitory effects against P. tolaasii, by measuring of the inhibitory radius zone (mm), via paper disc method (5mg per paper disc). Finally, the supernatants of selected isolates were fractionated by vacuum liquid chromatography using acetonitrile solvent (10, 20, 40, 60, 80, 100 % density) with RP-18 column chromatography in vacuum conditions, and the inhibitory effect of these fractions examined via paper disc methods. The results showed that six isolates out of 40 endofungal bacteria had the ability to inhibit the growth of P. tolaasii. Among them, Pseudomonas koreensis with 16.97 ± 0.65 and Pseudomonas chlororaphis with 9.87±0.35 mm inhibitory radius zone showed the highest and lowest inhibition effects, respectively. Also, the inhibitory effect of ethyl acetate crude extract showed that P. koreensis had remarkable activity against P. tolaasii with 20.75±1.04 mm inhibitory radius zone. Six organic compound fractions were obtained and their inhibitory effect showed that the third fraction of P. koreensis and Bacillus mycoides, the fifth fraction of Enterobacter sp. and P. koreensis, the sixth fraction of P. koreensis had inhibitory activity against P. tolaasii. In conclusion, some endofungal bacteria were able to produce antimicrobial organic compounds, which have a potential to controlling brown blotch disease.
Keywords
Ethyl acetate, Pseudomonas tolaasii, Vacuum Liquid Chromatography