تکثیر، همسانه سازی و آنالیز تبارزائی ژن کامل و ناقص NSs ویروس پژمردگی لکه‌ای گوجه فرنگی
کد مقاله : 1294-24IPPC (R3)
نویسندگان
1گیاهپزشکی-کشاورزی-دانشگاه زنجان -زنجان -ایران
2گروه گیاهپزشکی. دانشکده کشاورزی. دانشگاه زنجان. زنجان ایران
چکیده
ویروس پژمردگی لکه‌ای گوجه‌فرنگی (tomato spotted wilt virus, TSWV) یکی از مخرب‌ترین ویروس‌‌های گیاهی است که سبب ایجاد بیماری‌در گیاهان زینتی و سبزیجات در دنیا و ایران می‌شود. TSWV متعلق به جنس Orthotospovirus و خانواده Tospoviridae است که توسط تریپس و به روش گردشی- تکثیری منتقل می‌شود. پیکره این ویروس چند‌وجهی بوده که با پوشش لیپو پروتئینی پوشیده شده و ژنوم این ویروس از سه آر‌ان‌ای تک رشته ای تشکیل شده است که رشته بزرگ‌تر بنام L قطبیت منفی دارد و دو رشته متوسط و کوچک دیگر به‌ترتیب بنام‌های Sو M هستند که حالت دو قطبی دارند. بمنظور تکثیر ژن NSs جدایه‌های ایرانی ویروس مورد مطالعه، دی‌ان‌ای مکمل (cDNA) این ویروس از روی آر‌ان‌ای کل استخراج شده از بافت برگ‌های جمع‌‌‌آوری شده گوجه‌فرنگی دارای علائم مشکوک با استفاده از کیت (Reverse transcription) RT کمپانی HyperscriptTM ساخته شد. با استفاده از دی‌ان‌ای مکمل ساخته شده بعنوان دی‌ان‌ای قالب، ژنوم ناقص و ژنوم کامل NSS ویروس TSWV به ترتیب با استفاده از یک جفت آغازگر اختصاصی شامل NSS2-F (آغازگر رفت) و NSS2-R (آغازگر برگشت( و یک جفت آغازگر اختصاصی دیگر شامل NSS1-F (آغازگر رفت) و NSS1-R (آغازگر برگشت) در واکنش زنجیره‌ای پلیمراز تکثیر شدند. نتایج RT-PCR نشان داد که قطعه مورد انتظار حدود 717 جفت بازی مربوط به ژنوم ناقص NSS و قطعه حدود 1500 جفت بازی مربوط به ژنوم کامل NSS این ویروس با استفاده از جفت آغازگرهای اختصاصی تکثیر یافته است. نماینده‌ای از قطعات تکثیر شده به درون ناقل پلاسمیدی pTG19-T الحاق و پلاسمید‌های نوترکیب به درون سلول‌های باکتریایی مستعد Escherichia coli سویه‌ی DH5α به روش شوک حرارتی منتقل شدند. همسانه‌سازی با استفاده از کیت همسانه‌سازی ( SinaClone, Tehran) انجام شد و کلنی‌های مثبت با روش کلونی پی‌سی‌آر غربال شدند. بعد از بررسی صحت درج قطعه‌ی مورد نظر درون پلاسمید pTG19 پلاسمید‌های نوترکیب برای تعیین ترادف نوکلئوتیدی به شرکت پیشگام ارسال شدند. ترادف‌های بدست آمده با ترادف‌های موجود در بانک ژن مقایسه شدند. نتایج نشان داد قطعات تکثیر یافته متعلق به ژن NSS ویروس پژمردگی لکه‌ای گوجه‌فرنگی هستند. مقایسه همردیف سازی توالی‌های بدست آمده بین جدایه‌های این ویروس و دیگر جدایه‌های ثبت شده در بانک ژن با استفاده از برنامه Clustal W در نرم افزار MEAG6 انجام شد. درخت تبارزائی مناطق ژنومی موردنظر با استفاده از برنامه MEGA6 و با روش Neighbor-joining ترسیم شد. نتایج آنالیز تبارزائی جدایه‌های ردیابی شده با جدایه-هائی که قبلا از ایران گزارش شده بودند نشان داد که جدایه‌های ردیابی شده در زیر شاخه‌ای قرار می‌گیرند که جدایه‌های ایرانی نیز در آن زیر شاخه هستند.
کلیدواژه ها