تهیه سازه ویروس لکه حلقوی نکروتیک هسته‌داران با استفاده از پلاسمید بیانی pET28 در باکتری Escherichia coli
کد مقاله : 1295-24IPPC (R3)
نویسندگان
1گروه گیاه پزشکی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه زنجان، زنجان، ایران
2گروه گیاهپزشکی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه زنجان، زنجان، ایران
3گیاهپزشکی، کشاورزی، زنجان، زنجان، ایران
چکیده
درختان میوه هسته‌دار توسط تعداد زیادی از ویروس‌ها آلوده می‌شوند. از جمله این ویروس‌ها، ویروس لکه حلقوی نکروتیک هسته‌داران Prunus necrotic ring spot virus (PNRSV, Ilarvirus, Bromoviridae))) است. این ویروس عامل یکی از مهم‌ترین بیماری‌های اقتصادی درختان میوه هسته‌دار در اروپا و آسیا در اکثر مناطق کشت درختان هسته‌دار است. یکی از روش‌های جلوگیری از گسترش و توسعه‌ی ویروس‌های گیاهی، شناسایی دقیق و به موقع آن‌ها است و روش‌های سرولوژیک که بر اساس واکنش بین آنتی‌بادی و آنتی‌ژن است، از جمله روش‌های نسبتاً ارزان و آسان در ردیابی و شناسایی ویروس ها است. هدف از این مطالعه، درج ژن پروتئین پوششی ویروس PNRSV در پلاسمید بیانی و تزریق پروتئین بیان شده به خرگوش به منظور تهیه آنتی بادی است. ابتدا ژن کدکننده پروتئین پوششی ویروس PNRSV با استفاده از آغازگرهای طراحی شده دارای جایگاه برش با آنزیم‌های مناسب (HindIII, BamHI) در آزمون پی سی آر تکثیر و پس از خالص‌سازی، با استفاده از آنزیم T4 DNA ligase درون پلاسمید pTG19 همسانه‌سازی شد. سپس پلاسمید نوترکیب (pTG19-PNRSV-CP) با استفاده از عمل ترانسفورماسیون به روش شوک حرارتی به داخل سویه‌ی DH5α باکتری E.coli انتقال داده شد و به منظور اطمینان از صحت سازه در پلاسمید، آزمون پی‌سی‌آر کلونی برای کلون‌های رشد یافته انجام شد. نتایج پی‌سی‌آر کلونی نشان دهنده حضور ژن مورد نظر درون پلاسیمد همسانه سازی بود. در مرحله بعد هر دو پلاسمید pTG19-PNRSV-CP و pET28 با آنزیم-های برشی BamHI و HindIII برش داده شدند و پس از خالص سازی از ژل، قطعه مربوط به ژن پروتئین پوششی درون پلاسمید بیان قرار گرفت. غربالگری با استفاده از آزمون پی‌سی‌آر کلونی و برش آنزیمی انجام شد. سپس نتایج تعیین توالی حاکی از درج صحیح قطعه درون پلاسمید بیان بود. سازه بیانی ساخته شده جهت بیان در سیستم پروکاریوتی به سویه BL21 (DE3) منتقل شد. عملیات بهینه سازی بیان با استفاده از غلظت های مختلف IPTG و زمان پس از القا در حال انجام است.
کلیدواژه ها