ساخت سازه بیانی حاوی ژن پروتئین پوششی ویروس ساقه شیاری سیب در باکتری Escherichia coli
کد مقاله : 1296-24IPPC (R3)
نویسندگان
1گروه گیاهپزشکی،دانشکده کشاورزی، دانشگاه زنجان، شهر زنجان
2گروه گیاهپزشکی،دانشکده کشاورزی،دانشگاه زنجان،زنجان،ایران
3گیاهپزشکی، کشاورزی، زنجان، زنجان، ایران
4گروه گیاهپزشکی،دانشکده کشاورزی،دانشگاه کردستان،سنندج،کردستان،ایران
چکیده
یروس ساقه شیاری سیب (Apple stem grooving virus) یکی از ویروس‌های مهم بیماری زای درختان سیب است که در خانواده Betaflexiviridae و جنس Capillovirus قرار دارد که به دلیل داشتن پیکره‌های رشته‌ای و قابل انعطاف، این خانواده را بتافلکسی ویریده نام گزاری کرده اند. این ویروس ها دارای علائم خفیف روی میزبان گاها نیز بدون علامت است. از آنجایی که خالص سازی ویروس‌ها یک فرآیند زمان‌گیر و نیاز به تجهیزاتی مانند اولتراسانتریفوژ است که در برخی آزمایشگاه‌ها در دسترس نمی‌باشد، به منظور غلبه بر این مشکل، بیان پروتئین‌های نوترکیب در سیستم پروکاریوتی مانند Escherichia coli انجام می‌شود، تا بتوان از این طریق آنتی بادی علیه ویروس عامل بیماری برای استفاده در ردیابی و معرفی کیت تشخیصی بیماری تولید نمود. هدف از انجام این تحقیق ساخت سازه‌ی بیانی ژن پروتئین پوششی ویروس در باکتری E.coli جهت بهینه سازی شرایط لازم برای خالص سازی و تولید پروتئین در سیستم پروکاریوتی است. . بدین منظور با طراحی آغازگرهای دارای جایگاه‌های برش آنزیمی BamHI و EcoRI جهت قرار دادن در قاب صحیح ، تکثیر ژن پروتئین پوششی کامل ویروس ساقه شیاری سیب با استفاده از آزمون پی سی آر صورت گرفت. سپس قطعه تکثیر شده با استفاده از T4 DNA Ligase به درون پلاسمید همسانه سازی (pTG19) منتقل گردید. در مرحله بعد پلاسمید pTG19-ASGV-CP با استفاده از آنزیم های برشی (BamHI و EcoRI) برش داده شد و قطعه مربوط به ژن پروتئین پوششی در پلاسمید بیانی pET28 که توسط همان آنزیم های برشی، برش خورده بود متصل شد. سازه جدید ساخته شده pET28-ASGV-CP با استفاده از روش شوک حرارتی به درون E. coli منتقل شد و پس از استخراج پلاسمید، سازه ساخته شده در دو جهت با پروموتور T7 و T7-terminator تعیین توالی شد. نتایج پی‌سی‌آر کلونی، هضم آنزیمی و تعیین توالی تایید کننده ساخت سازه pET28-ASGV-CP بود. پلاسمید نوترکیب تایید شد. برای تایید ساخت سازه بیانی پس از غربالگری با کلونی پی سی آر تعیین توالی جهت قرار گرفتن صحیح قاب در پلاسمید بیانی انجام شد. سازه ساخته شده برای انتقال به میزبان بیانی به منظور بیان ژن پروتئین پوششی استفاده خواهد شد.
کلیدواژه ها