ساخت سازه‌های بیانی از ژنهای ویروس ایرانی پیچیدگی بوته چغندرقند (Beet curly top Iran virus ) با استفاده از وکتور ویروسی Tobacco rattle virus
کد مقاله : 1346-24IPPC (R3)
نویسندگان
1گیاهپزشکی/دانشگاه زنجان/زنجان/ ایران
2گیاهپزشکی، کشاورزی، زنجان، زنجان، ایران
3گروه گیاهپزشکی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه زنجان، زنجان، ایران
چکیده
ویروس ایرانی پیچیدگی بوته چغندرقند (Beet curly top Iran virus, BCITV)، یک ویروس تک رشته‌ی با دی‌ان‌ای حلقوی متعلق به جنس بکورتوویروس (Becurtovirus) از خانواده Geminiviridae است که به عنوان یکی از عوامل ایجاد کننده بیماری پیچیدگی بوته در گیاهان شناخته می شود. این ویروس دارای پنج چارچوب ژنی در سطح ژنوم خود است. سه چارچوب ژنی در رشته ویریون کد کننده پروتئین حرکتی (MP)، پروتئین تنظیم‌کننده (Reg) و پروتئین پوششی (CP) و دو چارچوب ژنی روی رشته مکمل کدکننده پروتئین A مرتبط با تکثیر و رپلیکاز هستند. از آنجاییکه استفاده از ویروس‌های گیاهی از جمله ویروس Tobacco rattle virus (TRV) کاربرد وسیعی به عنوان وکتور در بروز ژن‌ها دارد، در این پژوهش به منظور تهیه سازه‌های ژنی BCTIV، انتقال و بیان جداگانه آن‌ها در گیاه توتون (Nicotiana benthamiana) از وکتور TRV استفاده شد. بدین منظور، ژنهای BCTIV توسط واکنش زنجیره‌ای پلیمراز با استفاده از آغازگرهای اختصاصی تکثیر و با استفاده از آنزیم‌های BamHI و XhoI برش داده شده و سپس در وکتور ویروسی TRV که در یک وکتور دوتایی (Binary vector) قرار گرفته است، همسانه‌سازی شدند. همسانه‌های ایجاد شده با کمک شوک حرارتی به سلول‌های مستعد E. coli (DH5α) منتقل شده و روی محیط کشت انتخابی حاوی آنتی‌بیوتیک کانامایسین کشت و با کمک پی‌سی‌آر غربالگری و سپس توالی یابی شدند. توالی بدست آمده حاصل از همسانه ها جهت اطمینان از صحت توالی‌ها با توالی ژنوم ویروسی مقایسه شد. این همسانه ها به سلول‌های مستعد اگروباکتریوم (C58) منتقل و سپس با روش اگرواینوکولیشن به گیاهان توتون تلقیح شدند. با استفاده از واکنش معکوس زنجیره‌ای پلیمراز پس از تهیه cDNA، حضور ژنهای BCITV توسط این وکتور در گیاه تایید شد. به عنوان کنترل، تعدادی از گیاهان با باکتری حامل وکتور ویروسی عاری از هرگونه ژن خارجی و همینطور با باکتری حامل وکتور ویروسی حاوی یک ژن مارکر (TRV-Red) تلقیح شدند. نتایج اولیه بر اساس مشاهدات فنوتیپی علایم بعد از 14 روز، بیانگر تنوع علایم در گیاه بود. آزمایش مذکور تکرار خواهد شد و پاسخ گیاهان توتون نسبت به هر کدام از ژن‌ها بصورت مجزا بررسی خواهد شد.
کلیدواژه ها