بررسی اثر و مکانیسم پروتئین ضد ویروسی گیاه لاله عباسی (MAP ) بر آلودگی ویروس موزاییک خیار در توتون
کد مقاله : 1717-24IPPC (R2)
نویسندگان
1دانشگاه آزاد اسلامی، واحد علوم و تحقیقات تهران
2. گروه گیاهپزشکی، دانشکده علوم کشاورزی و صنایع غذایی، واحد علوم و تحقیقات دانشگاه آزاد اسلامی، تهران، ایران. صندوق پستی: 775-14515
3مرکز تحقیقات بیولوژی مادرید
4مرکز تحقیقات بیوتکنولوژی کشاورزی(ABRI)
چکیده
گیاهان مجموعه گسترده ای از مکانیسم های دفاعی ذاتی برای حفاظت از خودشان در مقابل حمله بیمارگرهای ویروسی و ویروئیدی در طول تکامل کسب کرده اند. یکی از مکانیسم های دفاعی به کار گرفته شده بوسیله تعدادی از گونه های گیاهان عالی ، مواد شیمیایی درگیرشونده ای هستند که ماهیت پروتئینی با وزن مولکولی کم داشته و پروتئین های غیرفعال کننده ریبوزوم Ribosome inactivating proteins (RIPs) نامیده می شوند. این مواد می توانند به میزان زیاد و در پاسخ به آلودگی به میکروارگانیسم ها و تنش های زیستی در گیاهان جمع شوند و با غیرفعال کردن ریبوزوم ها فرآیند پروتئین سازی را متوقف نمایند. عصاره خام گیاه لاله عباسی Mirabilis jalapa L. حاوی مقادیر زیادی مهار کننده تکثیر ویروس به نام MAP می باشد. در گذشته مشخص شده است که MAP بطور موثری می تواند مانع آلودگی ویروسی در گیاهان شود. در این مطالعه، ژن پروتئین ضد ویروسی گیاه لاله عباسی، توسط RT-PCR از RNA استخراج شده از گیاه لاله عباسی جمع آوری شده از شهر تهران به دست آمد و در یک پلاسمید بدون پروموتور همسانه سازی شد. توالی نوکلئوتیدی و آمینواسیدی آن تعیین گردید و مشابهت آن با توالی های نظیر در بانک ژن مقایسه شد. 2 ناحیه ی بازدارنده ی ریبوزومی بالقوه در توالی پروتئین MAP تهران مشاهده شد. سپس توالیMAP تهران توسط ناقل ژنتیکی دوتائی نوترکیب جهت بیان موقت آن در برگ های گیاهان محک به وسیله اگرواینفیلتریشن وارد شد. هم چنین مکان یابی بیان پروتئین MAP همراه با مارکرهای فلورسنت در نواحی N و C در گیاهان در گیاه Nicotiana Benthamiana و گوجه فرنگی تزریق و توسط میکروسکوپ کانفوکال فلورسنت مورد مطالعه قرار گرفت. از دو سازه ی ژنتیکی خرد mRFP نوترکیب شده که MAP به پایانه ی N و یا C آن متصل بود برای سنجش BiFC استفاده شد. اگرواینفیلتریشن هر یک از سازه ها به طور جداگانه و یا با هم صورت گرفت و در گیاهان تزریق شده ی مورد بررسی که قبلا با CMV نشاندار شده با مارکر گزارشگر مایه کوبی شده بودند ، صورت گرفت که بیان مارکر گزارشگر متصل به ویروس CMV ای که به صورت مکانیکی آلوده شده بود، کاهش یافت و بعد از 4 روز از وارد شدن سازه ها در گیاه Nicotiana Benthamiana به صورت کاملا مشهودی لکه های نکروتیک دیده شد. با جایگزینی دوبل-آلانین در پایانه ی C (Glu→Ala, Arg→Ala) در سازه های به دست آمده، پس از اگرواینفیلتریشن دیگر لکه های نکروتیک دیده نشدند در حالی که بیان گزارشگرها کاهش نیافت. بیان موقت پروتئین MAP در محیط آزمایشگاهی، نوید ابزار قدرتمندی را در مطالعات کاربردی و گسترده ی این پروتئین ضد ویروسی فراهم می سازد.
کلیدواژه ها
Title
Molecular characterization and transient expression
in plants of a Mirabilis jalapa antiviral protein (MAP),
and its use in functional studies
Authors
Abstract
Crude protein fractions from Mirabilis
jalapa of northern Iran containing Mirabilis Antiviral
Protein (MAP) reduced the systemic accumulation of
a plant RNA virus in Nicotiana benthamiana. A MAP
gene was amplified by RT-PCR from total RNAs iso-
lated from these Iranian M. jalapa plants (MAP-Teh-
ran) without the 5´-end signal peptide sequence, to
set up an experimental system that would transiently
express the protein in the cell cytosol by agroinfiltra-
tion and simultaneously trigger a response to study
its antiviral effects. The amplified fragment was first cloned into a high-copy plasmid without promot-
ers flanking the cloning site and its nucleotide and
amino acid sequences were determined and compared
to available MAP sequences. Two putative ribosome
inhibitor domains were found in the protein N-termi-
nal and C-terminal regions, respectively. The cloned
MAP-Tehran was transferred to binary vectors for
agroinfiltration. Only constructs that expressed MAP-
Tehran fused to the N- or C- halves of the monomeric
red fluorescent protein used for bimolecular fluores-
cence complementation assays were obtained. In N.
benthamiana leaves agroinfiltrated with these con-
structs, signs of cell plasmolysis became detectable
under confocal microscopy at day 3 after infiltration
(dai), and from day 4 necrotic lesions were visible. In
agroinfiltrated patches at 2–3 dai, before the onset of
cell death, reduced accumulation of a co-expressed
reporter gene and also of a mechanically inoculated
virus were observed. A double-alanine substitution
(Glu → Ala, Arg → Ala) in the C-terminal region
inhibitor domain of the MAP constructs sufficed to
abolish all of these effects. Agroinfiltration of either
the necrosis-inducing or non-inducing MAP vari-
ants caused no significant effect on the accumulation
of an RNA virus inoculated on upper, non-infiltrated
leaves.
jalapa of northern Iran containing Mirabilis Antiviral
Protein (MAP) reduced the systemic accumulation of
a plant RNA virus in Nicotiana benthamiana. A MAP
gene was amplified by RT-PCR from total RNAs iso-
lated from these Iranian M. jalapa plants (MAP-Teh-
ran) without the 5´-end signal peptide sequence, to
set up an experimental system that would transiently
express the protein in the cell cytosol by agroinfiltra-
tion and simultaneously trigger a response to study
its antiviral effects. The amplified fragment was first cloned into a high-copy plasmid without promot-
ers flanking the cloning site and its nucleotide and
amino acid sequences were determined and compared
to available MAP sequences. Two putative ribosome
inhibitor domains were found in the protein N-termi-
nal and C-terminal regions, respectively. The cloned
MAP-Tehran was transferred to binary vectors for
agroinfiltration. Only constructs that expressed MAP-
Tehran fused to the N- or C- halves of the monomeric
red fluorescent protein used for bimolecular fluores-
cence complementation assays were obtained. In N.
benthamiana leaves agroinfiltrated with these con-
structs, signs of cell plasmolysis became detectable
under confocal microscopy at day 3 after infiltration
(dai), and from day 4 necrotic lesions were visible. In
agroinfiltrated patches at 2–3 dai, before the onset of
cell death, reduced accumulation of a co-expressed
reporter gene and also of a mechanically inoculated
virus were observed. A double-alanine substitution
(Glu → Ala, Arg → Ala) in the C-terminal region
inhibitor domain of the MAP constructs sufficed to
abolish all of these effects. Agroinfiltration of either
the necrosis-inducing or non-inducing MAP vari-
ants caused no significant effect on the accumulation
of an RNA virus inoculated on upper, non-infiltrated
leaves.
Keywords
Antiviral effects of RIPs in plants , Antiviral effect of MAP in plants , Transient expression of RIPs in plants , ·, Transient expression of MAP in plants