ردیابی مولکولی Olpidium virulentus، قارچ ناقل ویروس سوختگی سیاه چغندر
کد مقاله : 1751-24IPPC (R3)
نویسندگان
1بخش تحقیقات ویروس شناسی گیاهی، موسسه تحقیقات گیاهپزشکی کشور، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی، تهران
2محقق/بخش تحقیقات ویروس شناسی گیاهی، موسسه تحقیقات گیاهپزشکی کشور، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی، تهران.
چکیده
ویروس سوختگی سیاه چغندر (Beet black scorch virus-BBSV) جزو جنس Betanecrovirus (خانواده Tombusviridae)، عامل یکی از بیماریهای ویروسی مهم در چغندرقند (Beta vulgaris) می باشد که تاکنون از مناطق مهم کشت این زراعت در دنیا و ایران گزارش شده است. قارچ خاکزی Olpidium brassica بعنوان ناقل طبیعی این ویروس گزارش شده است که اخیرا جمعیت‌های ناقل ویروسی از این جنس که کلونیزه کننده گیاهان غیرکروسیفری هستند را در گونه O. virulentus رده‌بندی نموده‌اند. در مطالعات پایش و تعیین پراکنش این ویروس در مناطق کشت چغندرقند، توسعه روشهای تشخیص مولکولی جهت ردیابی نوع قارچ ناقل، از نیازهای مهم می-باشد. برای این منظور در این تحقیق، 15 نمونه خاک از مزارع چغندرقند با سابقه آلودگی به BBSV در استانهای خراسان رضوی و کرمانشاه (بترتیب 8 و 7 نمونه) جمع‌آوری شد. این نمونه‌ها به تفکیک در گلخانه به نسبت یک به یک با ماسه استریل مخلوط شد و بذور چغندرقند رقم جلگه (حساس) پس از ضدعفونی سطحی وشستشو با آب مقطر استریل، در آنها کشت گردید. پس از یک ماه، گیاهچه‌ها از خاک خارج و ریشه ها با آب مقطر استریل شستشو داده شد. مقداری از ریشه با استفاده از روش الایزا (آنتی‌بادی اختصاصی BBSV) مورد آزمون قرارگرفته و آلودگی به BBSV در 4 و 3 نمونه خاک بترتیب از خراسان رضوی و کرمانشاه تایید گردید. یک قطعه ریشه (پنج صدم گرم) از نمونه‌های الایزا مثبت انتخاب و در نیم میلیلیتر محلول سوکروز 1% حاوی پنج صدم مولار گلایسین درون میکروتیوب بمدت یک ساعت در دمای اتاق قرارداده شد. سپس قطعه ریشه از میکروتیوب خارج و زئوسپورهای رها شده از ریشه، طی سانتریفیوژ رسوب داده شدند. بخش DNA زئوسپورها با استفاده از روش CTAB استخراج شد. جهت بررسی وضعیت حضور قارچ ناقل در نمونه‌های مورد بررسی از آزمون PCR به کمک آغازگرهای اختصاصی توصیفی جهت ردیابی O. brassica، O. bornovanus و O. virulentus استفاده شد. برنامه واکنش PCR شامل 5 دقیقه در 94 درجه سانتیگراد، سپس 35 چرخه مشتمل بر 45 ثانیه در 94 درجه، یک دقیقه در 55 درجه و یک دقیقه در 72 درجه و در نهایت 10 دقیقه در 72 درجه سانتیگراد بود. بررسی محصولات واکنش روی ژل آگارز، نشان دهنده تکثیر یک قطعه DNA بطول حدود 580 جفت باز در نمونه‌های مورد بررسی بود که با قطعه مورد انتظار برای O. virulentus مطابقت داشت. توالی نوکلئوتیدی این قطعه DNA تعیین و با استفاده از ابزار جستجوی BLAST با توالی‌های موجود در بانک ژن جهانی مقایسه شدند. نتایج حاصله نشان دهنده وجود بیشترین درصد یکنواختی آن (بالای 98%) با توالی‌های گزارش شده از O. virulentus بود (AB205208). بر اساس این نتایج، قارچ ناقل O. virulentus برای اولین بار با استفاده از روش مولکولی PCR در نمونه خاکهای تهیه شده از مزارع استانهای خراسان رضوی و کرمانشاه شناسایی و گزارش می‌شود.
کلیدواژه ها