همسانه سازی و بیان ژن پروتئین پوششی ویروس همراه پیچیدگی برگ انگور -3 در باکتری E. coli

کد مقاله : 1762-24IPPC (R3)

¹رضا پوررحیم ؛ ²شیرین فرزادفر

¹محقق/بخش تحقیقات ویروس شناسی گیاهی، موسسه تحقیقات گیاهپزشکی کشور، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی، تهران.

²بخش تحقیقات ویروس شناسی گیاهی، موسسه تحقیقات گیاهپزشکی کشور، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی، تهران

ویروس همراه پیچیدگی برگ انگور -3 (Grapevine leaf roll associated virus-3, GLRaV3) متعلق به جنس Ampelovirus از خانواده Closteroviridae است. این ویروس در ایران و بسیاری از کشورهای جهان شیوع داشته و با ایجاد آلودگی در انگور موجب بروز علائم سبزردی و پیچیدگی برگ‌ها در ارقام دانه سفید و بروز رنگ ارغوانی تا قرمز در ارقام با میوه رنگی و در نهایت خسارت اقتصادی می-شود. به دلیل تکثیر رویشی انگور از طریق قلمه، بیماریهای ویروسی از جمله GLRaV3 در این گیاه شیوع و اهمیت اقتصادی بیشتری دارد. از مهمترین روش‌ها برای مدیریت این بیماری، استفاده از مواد گیاهی ازدیادی سالم و عاری از ویروس است. در توسعه و بکارگیری آزمون الایزا بعنوان یک روش بسیار معمول در ردیابی و پایش آلودگی‌های ویروسی، دسترسی به مقادیر کافی از پروتئین پوششی ویروس (بعنوان آنتی‌ژن) جهت تهیه آنتی بادی اختصاصی و باکیفیت یک نیاز مبرم محسوب میشود. در این تحقیق ژن پروتئین پوششی (CP) ویروس GLRaV3 طی واکنش RT-PCR تکثیر و همسانه سازی شد. طی نمونه برداری از تاکستان‌های استان قزوین، نمونه‌های برگی با علائم سبزردی تهیه شده و با استفاده از آزمون الایزا آلودگی آنها به GLRaV3 مورد بررسی قرارگرفت. نمونه‌های با واکنش مثبت در آزمون الایزا انتخاب شده و RNA کل آنها با استفاده از روش CTAB از بافت‌های دمبرگ و رگبرگهای اصلی استخراج شد. آزمون RT-PCR با استفاده از آغازگرهای طراحی شده در این تحقیق جهت تکثیر ژن CP انجام گردید. آغازگرهای بالا و پایین دست بتریتب دارای جایگاههای آنزیم برشی Nde I و Bam HI در انتهای 5’ بودند. پس از آزمون RT-PCR، قطعه DNA تکثیر یافته با طول مورد انتظار 967 جفت باز از اجزا واکنش استخراج شد. این قطعه DNA پس از هضم آنزیمی، در ناقل بیانی pET28 همسانه سازی و به روش شک حرارتی به سلولهای E. coli مستعد سویه BL21 ترانسفورم شد. کلنی‌های نوترکیب انتخاب و به کمک آغازگرهای عمومی M13 توالی نوکلئوتیدی قطعه الحاقی (ژن CP) در آنها تعیین شد. کلنی های نوترکیبی که ژن CP الحاقی در آنها از نظر توالی نوکلئوتیدی و موقعیت قاب خواندنی فاقد خطا بودند، برای ادامه کار انتخاب شدند. این کلنیها در محیط کشت LB رشد داده شده و ژن CP آنها طی تحریک با علظت3/. میلی مولار IPTG در دمای 28 درجه سانتیگراد بیان شد. بررسی آموده پروتئینی استخراجی از باکتریها به روش SDS-PAGE، نشان دهنده بیان یک پروتئین با وزن مورد انتظار حدود 5/35 کیلودالتون بود. پروتئین بیان شده که در انتهای آمینی خود دارای دنباله 6His بود، با استفاده از ستون Ni-NTA (ًQiagen، آمریکا) استخراج شد. در آزمون‌های وسترن بلات و الایزا، این پروتئین با آنتی‌بادی تجاری اختصاصی GLRaV3 (بیوربا، سوئیس) واکنش مثبت داشت. در مراحل بعدی، از این پروتئین نوترکیب (rCP) برای تزریق به خرگوش و تهیه آنتی بادی اختصاصی پلی‌کلنال استفاده خواهد شد.

نهال؛ الایزا؛ پروتئین نوترکیب